尼康共聚焦显微镜-基础知识
AOTF（Acousto-optical tunable filter ）
AOTF，即所谓的声光调制滤光片。顺利获得施加在AOTF上的射频信号，可以选择激光的波长，调节激光的强度。在A1 confocal中，激光器顺利获得AOTF之后进入共聚焦扫描头。
当我们在NIS-Elements软件中选择激光波长和调节激光强度时，就是顺利获得AOTF来实现的。
Binary
Binary即二值化蒙板。在NIS-Elements里面，Binary是用来圈定测量范围的一个工具。
举例来说，我们有如下图像：
顺利获得Threshold工具，我们可以指定一个强度范围（715-4746），所有强度在这个范围之内的像素会被选中，生成一个Binary图层（像素值只有0和1两种数值。0对应的像素不被选中，1对应的像素被选中）。
就像把一张黑纸蒙在原图上，然后在黑纸上挖出一些洞（白色部分），把需要测量的部分露出来。
这样，原图叠加上Binary图层，显示如下：
Binary图层是进行自动测量的基础。
在NIS-Elements中，我们还可以顺利获得Binary Layers工具，对多个Binary进行操作，得到其交集，并集等新的Binary。
Bit Depth
数字图像是由一个个的像素（Pixel）组成的。每个Pixel对应一个灰度值（grayscale），也就是NIS-Elements软件中的强度值（Intensity）。
Bit Depth指的是用几个bit来记录pixel的Intensity。
如果Bit Depth=1，用1个bit来记录Intensity，那么Intensity只能有两种状态（2的1次方）：要么是0，要么是1；
如果Bit Depth=2，用2个bit来记录Intensity，则Intensity能有4种状态（2的2次方）：0（00），1（01），2（10）；3（11）；
同理，当Bit Depth=8时，Intensity能有256（2的8次方）种状态，从0到255。
Bit Depth越高，就意味着图像可以记录更丰富的灰度层次，灰度更加细腻，精确。
A1拍摄的图像Bit Depth=12，对应的Intensity有4096（2的12次方）级，从0到4095。
在NIS-Elements的图像窗口右下方信息栏中，我们可以看到当前图像的Bit Depth以及光标处像素的Intensity。
注意：在Windows以及Word，PowerPoint等软件中，支持8bit的图像。所以，如果我们想在windows下直接打开或者在Word等应用程序中插入图像时，需要把12bit的图像转化为8bit。
Cross Talk荧光串色
在进行多通道拍摄时，容易出现荧光串色的现象。
比如，拍摄FITC（绿色）+TxRed（红色）时，
如果同时打开488nm激光和561nm激光，同时拍摄绿色和红色荧光时，FITC的荧光有可能会串到红色通道，对红色通道造成干扰。如下图：
解决方法：
采用Ch Series模式，每次只拍摄一个通道，顺次拍摄。
具体的说，就是：先只打开488nm激光，拍摄绿色通道；然后只打开561nm激光，只拍摄红色通道。
这样就能有效减少荧光的串色现象。
HV（High Voltage）
在A1 confocal中，用来记录荧光强度的设备是PMT（PhotoMultiplier Tube，光电倍增管）。
当荧光分子撞击到PMT靶面后，会转化为光子，光子数经过多级电极之间的放大后输出，再经过特定的转换电路，成为图像中pixel对应的Intensity数值。
当增大PMT的电压HV时，PMT输出的光子数更多，会得到更亮的图像。
但是HV增大会导致图像中噪声的增加。
因此在拍摄时我们要根据标本的实际情况选择合适的HV。
相关信息可以参照“S/N信噪比”词条。
LUT（Look-up Table ）
在NIS-Elements软件中，LUT是一种用来调节图像亮度和对比度的方式。
移动左侧黑色三角对应的竖线，通常用来消除背景荧光；
移动右侧白色三角对应的竖线，通常用来增强物镜荧光；
移动斜线上的菱形块，可以改变Gamma值（改变图像对比度的一种方法）。
注意：调节LUT时改变的只是图像的显示效果，并不会改变图像的原始数据，因此是安全的。另外，LUT相关的功能按钮也集成在NIS-Elements的图像窗口，随时可以进行LUT操作（包括在拍摄预览的时候）。
ND拍摄（N Dimensions）
NIS-Elements可以很方便的进行多达6个维度的拍摄。
这些维度包括：
XY ：一个平面图像；
Z ：空间立体扫描；
T ：时间维度。记录标本的动态变化；
入 ：波长维度。拍摄多通道图像（注意：这个维度主要用于CCD成像，A1 confocal通常不需要）；
M ：多视野。可以事先定义好多个视野，同时拍摄这多个视野（注意：需要电动载物台）
nd2文件
nd2文件是NIS-Elements的标准格式。在一个nd2文件中可以同时记录多达6个维度的信息，在查看和分析图像时非常方便。
如下图所示，该nd2文件同时记录了X，Y，T（5个时间点），M（20个视野）以及GFP和DIC两个通道的信息。T和M维度有各自对应的播放区。
除此之外，nd2文件还记录了拍摄时完整的设备信息。比如：定标信息，曝光时间，激光强度……
相关信息可以很方便的进行再现。在拍摄条件需要严格一致的情况下（比如对照实验），再现功能非常有用。
OC（Optical Configuration）
在NIS-Elements软件中，可以把多个设备的特定状态组合起来，生成一个OC按钮。单击该按钮，就可以使仪器快速切换到所需要的状态。
比如：在目镜下观察GFP时，我们需要一系列动作。
1． 关掉透射光光源；
2． 把荧光滤色块转盘转到GFP（或B-2A等）位置；
3． 光路切换到目镜；
4． 打开荧光光源的光闸。
各个部件状态到位之后，我们可以点击
生成一个OC按钮，命名为“GFP”。以后只需要点击GFP这个OC按钮，系统就会自动切换到在目镜下观察GFP的状态。
简单来说，OC就是“一键切换”。
OC可以关联的设备包括：
此外，OC还是nd拍摄中Lambda模式的基础。
ROI（Region of Interest）
在NIS-Elements软件中，可以灵活地生成一系列ROI，用于下列操作：
对ROI内图像进行统计，测量；
和Binary结合，一起限定测量的区域；
可以指定为Background ROI，定义背景荧光的强度；
可以指定为Stimulation ROI，定义光刺激区域
……
ROI对应一个独立的图层，可以随时打开或者关闭该图层。
ROI和Binary之间还可以相互进行转化。
S/N信噪比（Signal to Noise Ratio ）
信噪比即仪器在采集信号时，信号强度和噪声强度的比率。比如用收音机收听广播时，如果出现“滋滋啦啦”的声音，则说明信噪比比较低。
具体到共聚焦图像上，可以理解为图像上随机出现的杂点的多少。
下面的例子中，左侧图像的信噪比就比较高。
在A1 Confocal拍摄时，PMT的HV设定过高，会出现噪点增加，信噪比下降的现象。因此，在拍摄时要选择合适的HV值。通常设在100左右。
此外，顺利获得Average模式可以有效提高信噪比。
